怎样避免液相色谱柱出现过载？

在选择液相色谱柱时通常会遇到一个问题：这根色谱柱能上多大的样品量？虽然在做分析时会尽量避免色谱柱过载，但经常会遇到一组分析物中同时包含了较高浓度的主成分（也就是药物活性成分）和很低浓度的杂质（包括工艺杂质及降解杂质），为了兼顾低浓度杂质的灵敏度，必然要增大进样体积或者提高进样浓度以确保定量的准确性，因此某些时候就会造成色谱柱的过载。色谱柱的过载可以分为质量过载和体积过载。

1、质量过载

质量过载又称为浓度过载，是指在小体积进样时（体积未过载），由于进样浓度较高，靠近谱峰峰带的固定相被饱和，也就是说进样某一组分超过了色谱柱的载样量而出现过载的现象。一般表现为色谱峰峰形拖尾，柱效较低。那么一般载样量是多少呢？通常对于内径为4.6mm的色谱柱，其载样量<50μg。如果是做方法转移到其他色谱柱上，则需要调整进样量，防止出现过载。

载样量主要与色谱柱固定相和待分析物的性质有关，首先固定相类型不一样，品牌不一样会造成载样量较大的差异。其次待分析物质性质也会直接影响到色谱柱载样量。例如离子态的碱性化合物就很容易过载，不仅无法达到<50μg的量级，有时候甚至1μg的量就能造成过载的现象。因此在常规疏水反相中，分子态的碱性化合物比离子态的碱性化合物有着更高的载样量。目前的推测原因是离子态间互相排斥作用使得待分析组分在固定相表面更易达到饱和而造成过载。同时离子态的带正电的碱性化合物也更容易和固定相中未键合的活性硅羟基发生次级相互作用。

针对质量超载的问题，最简单的方法则是减少进样量。

2、体积过载

进样体积太大通常会导致较宽的平头峰，还会影响峰保留时间。体积过载对保留时间短的组分影响更大，而对于较后面流出的峰影响较小。那么如何选择合适的进样体积呢？

对于在最佳流速下 ，允许样品进样的Z大体积为：

其中：L为柱长（mm），dc为内径（mm），dp为粒径（μm）

常用的各规格色谱柱最大进样体积如下表：

注：最大进样体积取的近似整数。上表中各个数据是严格按照公式计算出来的，但是这个数据并不绝对。