高效液相色谱、串联质谱法检测中药材中有机磷农药残留量
点击: 次 时间:2017-05-22 10:59
摘要:研究了中药材中有机磷农药残留量的高效液相色谱..串联质谱同步检测方法。采用CAPCELLPAKMGC18反相柱,以乙腈为提取溶液,以Carb/PSA柱为净化柱,液相色谱..串联质谱仪测定。方法线性范围为10~500..g/L,11种有机磷农药在此范围内线性良好,相关系数为0..9961~0..9999。在10~100..g/kg浓度范围内,加标回收率在70%~110%之间,相对标准偏差为1..4%~11%,最低检出限为2~20..g/kg,符合残留检测分析要求。
关键词:高效液相色谱..串联质谱;中药材;有机磷农药;多农药残留
有机磷农药大量使用会在农作物中产生蓄积，作用,对人畜构成威胁,也会对环境产生负面影响。目前,我国中药材中有机磷农药残留分析研究，较少[1~3],使用较多的检测方法为气相色谱法[4],，也有使用气质联用法[5],但较少使用液质联用法。由于大多数中药材成分复杂,对于复杂样品多残留痕量分析,气相色谱和气质连用抗干扰能力较差,对样品前处理技术要求较高,而高效液相色谱..串联质谱仪可以进行二级质谱分析,抗干扰能力较强,对前处理要求较低。通过选择监测离子对一些成分复杂、背景较..脏..的样品进行准确的定性和定量分析,比较适合中药材中农药多残留检测分析。本研究采用固相萃取净化结合高效液相色谱.串联质谱检测的方法建立了栀子、玄参、车前草、甘草及金银花等中药材中11种有机磷农药的多残。
检测方法
1..实验部分
1..仪器与材料
液相色谱..三重四极杆质谱联用仪;粉粹机;台式，离心机(最高转速4500r/min);超声波清洗器;氮气吹干仪;旋转蒸发仪;旋涡混合器;固相萃，取仪。甲醇和乙腈均为色谱纯;甲苯、丙酮、无水硫酸，钠为分析纯;甲酸:纯度>98%;活性炭;Carb/PSA双层固相萃取柱(500mgCarb/500mgPSA/6mL)。标准品:敌敌畏;地虫硫磷;杀扑磷;二嗪磷;甲基嘧啶磷;甲基谷硫磷;马拉硫磷;毒死蜱;毒虫畏;伏杀硫磷;乙硫磷。丙酮配制标准储备溶液(100mg/L)。实验药材:栀子、玄参、车前草、甘草及金银花。
2..样品提取
称取粉碎、过0..45mm筛后的中药材样品5..0g于50mL塑料离心管中,加入30mL乙腈,加入5g无水硫酸钠,盖上盖子,用手剧烈震荡使其混合均匀,超声30min,3500r/min离心5min,取15mL上清液于100mL梨形瓶中,35..下旋转蒸发至干,待净化。
3..样品净化
在Carb/PSA柱中加入0..5g活性炭,预先用4mL乙腈..甲苯(体积比为3:1)活化小柱,用10mL
乙腈..甲苯(体积比为3:1)分三次溶解蒸干后残过柱,收集流出液,用20mL乙腈..甲苯(体积比为3:1)洗脱,收集流出液,合并流出液于平底烧中,35..下旋转蒸发至0..5mL左右,氮气吹干,用1mL乙腈溶解,过0..22..m滤膜后测定。
1..4..液相色谱条件
色谱柱:CAPCELLPAKMGC18柱(100mm.2..0mm.id.,3..m);柱温:室温;流速:200..L/min;进样体积:10..L;流动相:V(0..1%甲酸水溶液):V(甲醇)=50:50,0~3min甲醇比例从50%线性增加至95%,然后保持4..5min,7..5~8min,线性恢复至初始流动相比例,然后平衡2min。
1..5..质谱分析条件
离子源:电喷雾离子化源(ESI);扫描模式:正离子模式;检测方式:选择反应检测(SRM);电喷雾电压:4000V;毛细管温度:350..;碰撞气:高纯度氩气;监测离子及对碰撞能量见表1。表1..ESI..MS/MS监测离子及对应碰撞能量有机磷农药母离子
1..6..线性关系考察实验准确吸取适量各农药标准品储备液,用空白品提取液在10~500..g/L范围内稀释成一系列不同浓度梯度,在选定的最佳液..质分离条件下进行测定,以样品中各有机磷农药的峰面积为纵坐标,含量(..g/L)为横坐标,绘制标准曲线。
1..7..回收率和精密度实验
称取5种中药材各5..0g,分别在10、50、100g/kg三个浓度下进行空白样品加标实验,分别按1..3中方法操作,每个浓度重复5次,测得平均回收率和精密度。
2、结果与讨论
2..1..色谱条件..
液质联用所用流动相中不能加入各种表面活性剂、难挥发盐及其他对质谱响应有抑制作用的物质,流动相可选范围较小,常用的为甲醇、乙腈、及其不同比例的混合物和一些易挥发性盐的缓冲液。本研究考察了甲醇..水溶液流动相体系,实验过程中加入适量的乙酸铵和甲酸,实验结果表明,在甲醇..水溶液中加入0..1%的甲酸有助于有机磷农药的离子化,响应值高。同时为了进一步改善峰形,缩短分析时间,采用了梯度洗脱,11种有机磷农药均在7min之内出峰,峰形良好,详见图1。
2..2..质谱条件..
在ESI正离子模式下,所有物质均有良好响应,可同时观察到其准分子离子峰。在对准分子离子进行二次质谱优化时又得到其碎片离子及各自的碰撞能量,选择碎片离子作为定性定量依据(见表1),保证了灵敏度和准确性。
2..3..样品提取剂..
有机磷农药具有一定极性,不同文献报道的取溶剂有所不同,本实验分别考察了乙酸乙酯、乙腈、丙酮、二氯甲烷和正己烷5种提取溶剂对11种有机磷农药的提取效率,结果表明,乙腈和二氯甲烷提取效率较高,但二氯甲烷提取的共提物较多,杂质干扰大,因此实验选择乙腈作为提取溶剂。
2..4..净化方式..
实验分别选择活性炭、C18、SAX、Carb/PSA固相萃取柱净化,结果表明,Carb/PSA固相萃取柱的净化效果较理想,而且可以保证11中有机磷农药的回收率均在70%以上。对于色素含量高的样品,在小柱中加入一定量的活性炭脱色效果更好。
2..5..线性关系和最低检出限..
按1..6方法操作,结果表明,5种中药材中11种有机磷农药在10~500..g/L浓度范围内线性关系良好,栀子、车前草、玄参、甘草及金银花中11种有机磷农药的线性相关系数为0..9961~0..9999。在空白样品中添加标准品做检出限实验,以信噪比大于3为依据,确立了方法的最低检出限,五种中药材中11种有机磷农药的最低检出限为2~20..g/kg,详见表2。
2..6..回收率和精密度..
按1..7方法操作,测得平均回收率和精密度,结果表明:在10~100..g/kg浓度范围内,栀子中11种有机磷农药平均回收率为84..0%~104..7%,相对标准偏差为1..4%~9..4%;车前草中有机磷农药平均回收率为71..6%~87..8%,相对标准偏差为2..7%~11%;玄参中有机磷农药平均回收率为73%~110%,相对标准偏差为1..8%~7..8%;甘草中有机磷农药平均回收率为70%~86..5%,相对标准偏差为3..3%~9..5%;金银花中有机磷农药平均回收率为72..5%~96..8%,相对平均偏差为2..2%~9..1%。
2..7..样品检测..
利用本文建立的方法对从6家药材店买回的，栀子、车前草、玄参、甘草及金银花等28个样品进行了检测,均未检出有机磷农药,并将本方法用于出口牛蒡中有机磷农药残留量检测,2009年共检测牛蒡样品284个,均未检出有机磷农药。
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关键词:高效液相色谱..串联质谱;中药材;有机磷农药;多农药残留
有机磷农药大量使用会在农作物中产生蓄积，作用,对人畜构成威胁,也会对环境产生负面影响。目前,我国中药材中有机磷农药残留分析研究，较少[1~3],使用较多的检测方法为气相色谱法[4],，也有使用气质联用法[5],但较少使用液质联用法。由于大多数中药材成分复杂,对于复杂样品多残留痕量分析,气相色谱和气质连用抗干扰能力较差,对样品前处理技术要求较高,而高效液相色谱..串联质谱仪可以进行二级质谱分析,抗干扰能力较强,对前处理要求较低。通过选择监测离子对一些成分复杂、背景较..脏..的样品进行准确的定性和定量分析,比较适合中药材中农药多残留检测分析。本研究采用固相萃取净化结合高效液相色谱.串联质谱检测的方法建立了栀子、玄参、车前草、甘草及金银花等中药材中11种有机磷农药的多残。
检测方法
1..实验部分
1..仪器与材料
液相色谱..三重四极杆质谱联用仪;粉粹机;台式，离心机(最高转速4500r/min);超声波清洗器;氮气吹干仪;旋转蒸发仪;旋涡混合器;固相萃，取仪。甲醇和乙腈均为色谱纯;甲苯、丙酮、无水硫酸，钠为分析纯;甲酸:纯度>98%;活性炭;Carb/PSA双层固相萃取柱(500mgCarb/500mgPSA/6mL)。标准品:敌敌畏;地虫硫磷;杀扑磷;二嗪磷;甲基嘧啶磷;甲基谷硫磷;马拉硫磷;毒死蜱;毒虫畏;伏杀硫磷;乙硫磷。丙酮配制标准储备溶液(100mg/L)。实验药材:栀子、玄参、车前草、甘草及金银花。
2..样品提取
称取粉碎、过0..45mm筛后的中药材样品5..0g于50mL塑料离心管中,加入30mL乙腈,加入5g无水硫酸钠,盖上盖子,用手剧烈震荡使其混合均匀,超声30min,3500r/min离心5min,取15mL上清液于100mL梨形瓶中,35..下旋转蒸发至干,待净化。
3..样品净化
在Carb/PSA柱中加入0..5g活性炭,预先用4mL乙腈..甲苯(体积比为3:1)活化小柱,用10mL
乙腈..甲苯(体积比为3:1)分三次溶解蒸干后残过柱,收集流出液,用20mL乙腈..甲苯(体积比为3:1)洗脱,收集流出液,合并流出液于平底烧中,35..下旋转蒸发至0..5mL左右,氮气吹干,用1mL乙腈溶解,过0..22..m滤膜后测定。
1..4..液相色谱条件
色谱柱:CAPCELLPAKMGC18柱(100mm.2..0mm.id.,3..m);柱温:室温;流速:200..L/min;进样体积:10..L;流动相:V(0..1%甲酸水溶液):V(甲醇)=50:50,0~3min甲醇比例从50%线性增加至95%,然后保持4..5min,7..5~8min,线性恢复至初始流动相比例,然后平衡2min。
1..5..质谱分析条件
离子源:电喷雾离子化源(ESI);扫描模式:正离子模式;检测方式:选择反应检测(SRM);电喷雾电压:4000V;毛细管温度:350..;碰撞气:高纯度氩气;监测离子及对碰撞能量见表1。表1..ESI..MS/MS监测离子及对应碰撞能量有机磷农药母离子
1..6..线性关系考察实验准确吸取适量各农药标准品储备液,用空白品提取液在10~500..g/L范围内稀释成一系列不同浓度梯度,在选定的最佳液..质分离条件下进行测定,以样品中各有机磷农药的峰面积为纵坐标,含量(..g/L)为横坐标,绘制标准曲线。
1..7..回收率和精密度实验
称取5种中药材各5..0g,分别在10、50、100g/kg三个浓度下进行空白样品加标实验,分别按1..3中方法操作,每个浓度重复5次,测得平均回收率和精密度。
2、结果与讨论
2..1..色谱条件..
液质联用所用流动相中不能加入各种表面活性剂、难挥发盐及其他对质谱响应有抑制作用的物质,流动相可选范围较小,常用的为甲醇、乙腈、及其不同比例的混合物和一些易挥发性盐的缓冲液。本研究考察了甲醇..水溶液流动相体系,实验过程中加入适量的乙酸铵和甲酸,实验结果表明,在甲醇..水溶液中加入0..1%的甲酸有助于有机磷农药的离子化,响应值高。同时为了进一步改善峰形,缩短分析时间,采用了梯度洗脱,11种有机磷农药均在7min之内出峰,峰形良好,详见图1。
2..2..质谱条件..
在ESI正离子模式下,所有物质均有良好响应,可同时观察到其准分子离子峰。在对准分子离子进行二次质谱优化时又得到其碎片离子及各自的碰撞能量,选择碎片离子作为定性定量依据(见表1),保证了灵敏度和准确性。
2..3..样品提取剂..
有机磷农药具有一定极性,不同文献报道的取溶剂有所不同,本实验分别考察了乙酸乙酯、乙腈、丙酮、二氯甲烷和正己烷5种提取溶剂对11种有机磷农药的提取效率,结果表明,乙腈和二氯甲烷提取效率较高,但二氯甲烷提取的共提物较多,杂质干扰大,因此实验选择乙腈作为提取溶剂。
2..4..净化方式..
实验分别选择活性炭、C18、SAX、Carb/PSA固相萃取柱净化,结果表明,Carb/PSA固相萃取柱的净化效果较理想,而且可以保证11中有机磷农药的回收率均在70%以上。对于色素含量高的样品,在小柱中加入一定量的活性炭脱色效果更好。
2..5..线性关系和最低检出限..
按1..6方法操作,结果表明,5种中药材中11种有机磷农药在10~500..g/L浓度范围内线性关系良好,栀子、车前草、玄参、甘草及金银花中11种有机磷农药的线性相关系数为0..9961~0..9999。在空白样品中添加标准品做检出限实验,以信噪比大于3为依据,确立了方法的最低检出限,五种中药材中11种有机磷农药的最低检出限为2~20..g/kg,详见表2。
2..6..回收率和精密度..
按1..7方法操作,测得平均回收率和精密度,结果表明:在10~100..g/kg浓度范围内,栀子中11种有机磷农药平均回收率为84..0%~104..7%,相对标准偏差为1..4%~9..4%;车前草中有机磷农药平均回收率为71..6%~87..8%,相对标准偏差为2..7%~11%;玄参中有机磷农药平均回收率为73%~110%,相对标准偏差为1..8%~7..8%;甘草中有机磷农药平均回收率为70%~86..5%,相对标准偏差为3..3%~9..5%;金银花中有机磷农药平均回收率为72..5%~96..8%,相对平均偏差为2..2%~9..1%。
2..7..样品检测..
利用本文建立的方法对从6家药材店买回的，栀子、车前草、玄参、甘草及金银花等28个样品进行了检测,均未检出有机磷农药,并将本方法用于出口牛蒡中有机磷农药残留量检测,2009年共检测牛蒡样品284个,均未检出有机磷农药。
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